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Certican®



Supporto Tecnico per gli Operatori

Innofluor® Certican® Assay

Suggerimenti e risposte alle domande più frequenti

Suggerimenti:

Condizioni per la conservazione e la manipolazione di reattivi, calibratori, controlli e campioni

Reattivi Innofluor® Certican®
Conservare i reattivi nei loro flaconi ben chiusi a 2-8°C al riparo dalla luce. Non utilizzare i reattivi oltre la data di scadenza riportata sulle confezioni o sulle etichette dei flaconi.

Calibratori e controlli Innofluor® Certican®:
Prima dell’apertura, conservare calibratori e controlli congelati. Dopo l’apertura, calibratori e controlli sono stabili fino a 6 settimane a 2-8°C. Non lasciare calibratori e controlli a temperatura ambiente se non per il tempo necessario per l’esecuzione del dosaggio. Non utilizzare calibratori e controlli oltre la data di scadenza riportata sulle confezioni o sulle etichette dei flaconi.

Campioni:
I campioni sono stabili fino a 3 giorni a 2-8°C; è possibile conservare i campioni di sangue intero a –20°C o a temperature inferiori per un periodo massimo di 28 giorni. Non sottoporre i campioni a ripetuti cicli di congelamento/scongelamento.

Prima di procedere all’estrazione, portare a temperatura ambiente calibratori, controlli e campioni. Dopo il completo scongelamento, agitarli più volte per inversione, evitando la formazione di bolle.

Estrazione dei calibratori e controlli Innofluor® Certican® e dei campioni

Il componente principale della procedura di estrazione è il metanolo. E’ importante non far trascorrere tempo tra l’estrazione di calibratori, controlli e campioni e l’esecuzione del dosaggio per prevenire l’evaporazione del metanolo. L’eventuale evaporazione del metanolo può generare risultati non corretti.

Dopo l’estrazione, calibratori e controlli saranno limpidi con una lieve colorazione bruna, mentre i campioni, per la presenza di EDTA, saranno limpidi ma presenteranno una debole o lieve colorazione verde. E’ normale il fatto che ci siano delle piccole chiazze brune sulla superficie interna delle provette da centrifuga, nei punti dove il materiale cellulare non si è staccato durante la fase di estrazione. Il precipitato deve essere compatto e non facilmente risospendibile. E’ normale che il surnatante presenti in sospensione un piccolo numero di precipitati brunastri, che non devono essere trasferiti nelle cuvette.

I reagenti e i calibratori Innofluor® Certican® servono per generare la curva di calibrazione nello strumento prima di eseguire il dosaggio di controlli e campioni.

Calibrazione dell’Innofluor® Certican®

E’ necessario eseguire due estrazioni distinte per ogni calibratore Innofluor® Certican® per generare una curva di calibrazione valida.

I valori dei calibratori sono lotto-specifici; per ogni lotto viene fornito un foglio che riporta i valori di ciascun calibratore. Prima di ogni dosaggio, verificare che sia corretto il valore riportato nei parametri dello strumento.

La curva di calibrazione deve rispettare alcuni parametri: i limiti PERR (errore di polarizzazione) devono essere compresi tra -2,0 e +2,0, i valori RMSE (errore quadratico medio) ≤ 1,0 e i valori dei controlli devono essere all’interno del loro intervallo, fornito nel foglio che accompagna la confezione. Se questi criteri non vengono rispettati, verificare che l’attivazione del dosaggio e i parametri riportati nello strumento siano corretti e ripetere la procedura di calibrazione.


Risposte alle domande più frequenti:

Perchè è necessario eseguire la calibrazione in duplicato?

Per una migliore accuratezza e precisione del dosaggio, vista l’imprecisione intrinseca dei metodi immunologici sulla valutazione degli immunosoppressori fatta su sangue intero, è stato verificato che l’esecuzione della calibrazione in duplicato fornisce una curva migliore e risultati clinici ottimali. Il dosaggio è stato convalidato con curva di calibrazione derivante da estrazioni in duplicato di calibratori, con un volume di campione di 600µL e con un volume di campione ridotto (300µL). Una curva calcolata da una estrazione di calibratori in singolo aumenta in modo considerevole l’errore di polarizzazione (PERR). Questo parametro è derivato dalla media delle letture dei campioni estratti in duplicato, da questa media viene estrapolata la curva di calibrazione. Se si esegue una curva di calibrazione in singolo si possono facilmente ottenere risultati che non validano il dosaggio.


Cosa provoca errori PERR e RMSE e come è possibile evitare questi errori?

Gli errori PERR, errori di polarizzazione,e RMSE, errore quadratico medio, sono i parametri utilizzati dallo strumento per stabilire se la curva di calibrazione è accettabile o no. Se per uno di questi parametri si ottengono valori esterni a quelli riportati nelle istruzioni del dosaggio, verificare che non siano presenti bolle d’aria nei campioni o all’interno dei tubi dello strumento, verificare che i valori impostati per i calibratori siano corretti, eventualmente sostituire il codice a barra del reagente, verificare le prestazioni della sonda dello strumento, il controllo fotoelettrico, la temperatura, i tamponi utilizzati, ecc. Una corretta tecnica di estrazione con l’utilizzo di pipette adeguatamente tarate è importante per ottenere risultati ottimali.


Cosa provoca la comparsa del messaggio di errore NOT MONOTONIC (non monotonico) e come si può ovviare al problema?

Il problema si pone quando la polarizzazione non si orienta in direzione costante. Spesso succede quando i calibratori non sono inseriti in ordine corretto e la fluorescenza non diminuisce come atteso. Controllare le istruzioni contenute nella metodica della confezione e i valori assegnati ai calibratori.


Cosa provoca la comparsa del messaggio di errore RANGE TOO LARGE (intervallo troppo esteso) e come si può ovviare al problema?

Il messaggio appare quando, durante la calibrazione, la differenza di polarizzazione o di intensità di fluorescenza percentuale tra i replicati dei calibratori è risultata superiore o uguale al valore del parametro di analisi 15 (6 m P). Questo può capitare in maniera occasionale, sia per un cattivo funzionamento dello strumento, che per la presenza di frustoli che interferiscono nella lettura delle cuvette. Se questo si verifica costantemente, verificare se esistano problemi sistematici nello strumento o se la tecnica di estrazione non sia corretta. Se si sospetta un malfunzionamento dello strumento, controllare la capacità dell’apparecchio di eseguire dispensazioni lineari secondo quanto riportato dal manuale di istruzioni.

Per determinare se la causa del messaggio di errore sia nella tecnica di estrazione, verificare visivamente che entrambi i surnatanti di uno stesso campione dopo estrazione appaiano identici; se uno appare più o meno opaco dell’altro, questo è un segno di una tecnica di estrazione non corretta e questo provoca una scarsa precisione tra i replicati. Non modificare le impostazioni dei parametri, ma controllare che le istruzioni del foglio applicativo della metodica e una corretta tecnica di estrazione vengano seguite fedelmente.


Perchè si possono trovare valori elevati per controlli e campioni?

Le cause possono essere numerose:

  • C’è stata una degradazione dei calibratori dovuta alla spedizione e/o alla loro conservazione. Riprovare a calibrare nuovamente lo strumento con nuovi calibratori (controllare se i parametri dei nuovi calibratori siano uguali ai precedenti ed eventualmente modificarli nello strumento).
  • E’ necessario ripetere la calibrazione. Di solito la curva di calibrazione dura almeno 2 settimane; i valori dei controlli tendono ad aumentare nel tempo. Se questo aumento supera i limiti riportati nel loro range di validità o i limiti di accettabilità del laboratorio, lo strumento deve essere ricalibrato. Una nuova calibrazione è necessaria quando si utilizza una nuova confezione di reattivi e deve essere eseguita per ogni nuovo lotto di reattivi.
  • Errore di estrazione – Verificare che le procedure utilizzate siano quelle riportate nelle istruzioni.
  • Malfunzionamento dello strumento – Verificare che la manutenzione dello strumento sia stata eseguita correttamente, secondo le specifiche riportate nel manuale dello strumento.

Perchè si possono trovare valori bassi per controlli e campioni?

Le cause possono essere numerose:

  • C’è stata una degradazione dei controlli dovuta alla spedizione e/o alla loro conservazione. Richiedere nuovi controlli ed inserirli nuovamente nel dosaggio.
  • I valori del lotto dei calibratori usati per calibrare sono diversi da quelli presenti nella memoria dello strumento. Controllare attentamente la concordanza tra i valori in memoria e quelli riportati sul foglio accluso alla confezione dei calibratori.
  • Se dopo l’estrazione il campione non viene dosato rapidamente e il surnatante rimane troppo a lungo a contatto con il precipitato, il farmaco può essere riassorbito dal film cellulare lipofilo del precipitato. I campioni devono essere dosati immediatamente dopo la centrifugazione o è necessario separare il surnatante dal precipitato e conservarlo a bassa temperatura in provette chiuse accuratamente.
  • Errore di estrazione – Verificare che le procedure utilizzate per estrarre controlli e campioni siano esattamente quelle riportate nelle istruzioni.
  • Malfunzionamento dello strumento – Verificare che le manutenzioni dello strumento siano state eseguite correttamente, secondo le specifiche riportate nel manuale del TDX. A questo proposito si ricorda che nel manuale dello strumento, al paragrafo 5, nella sezione MANUTENZIONE, sono riportate le procedure raccomandate del sistema TDX /TDXFLX con le istruzioni dettagliate per eseguire tali procedure. Si raccomanda all’operatore di attenersi scrupolosamente a tutto ciò che è indicato in questa sezione.

A cosa è dovuta una scarsa precisione del dosaggio?

Una scarsa precisione può essere dovuta a una serie di fattori:

  • Si è proceduto all’estrazione dei calibratori e controlli prima che questi si siano sciolti completamente e senza che siano stati miscelati accuratamente.
  • Troppo tempo trascorso tra l’estrazione e il dosaggio dei controlli e calibratori.
  • Strumento – siringhe rotte o allentate, tubicini rotti o allentati, usura delle guarnizioni. Controllare la manutenzione dello strumento e provare ad eseguire sullo strumento un dosaggio diverso.
  • Possibile trascinamento– Sonde sporche o deteriorate possono provocare trascinamento. Sul manuale dello strumento si trovano le procedure per valutare il trascinamento.