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Method of the Year 2022: long-read sequencing
“Long-read sequencing powers a more complete reading of genomic information.”
La scorsa estate è stato raggiunto uno degli obiettivi più ambiziosi nella comprensione del genoma umano da quando lo Human Genome Projec (HGP) è stato concluso: il primo sequenziamento umano completo da telemero a telemero (T2T), che ha permesso di decodificare il restante 8% del genoma (DOI: 10.1126/science.abj6987).
Il progetto è stato condotto dal consorzio T2T ed è stato possibile grazie ad un imponente sforzo sperimentale in cui il ruolo più importante è stato svolto dalla tecnologia di sequenziamento long-reads. Il long- read ha infatti permesso, finalmente, di conoscere quasi 200 milioni di paia di basi di in più, contenenti 1956 predizioni geniche 99 delle quali si prevede codifichino proteine. Le regioni completate includono, tra l’altro, i satelliti centromerici, le duplicazioni segmentali e i bracci corti di tutti e cinque i cromosomi acrocentrici, sbloccando queste complesse regioni del genoma per futuri studi funzionali (DOI: 10.1126/science.abj6987).
Questo risultato è stato fondamentale nel decretare la tecnologia di sequenziamento long-reads, conosciuta anche come sequenziamento di terza generazione, tecnica dell’anno 2022.
Questo progetto è però solo uno degli esempi in cui la tecnologia long-reads trova la sua applicazione.
Il long-reads è la tecnica di elezione per la lettura di genomi, trascrittomi ed epigenomi nell'uomo e in altre specie con un’ampia applicabilità alla metagenomica.
Le due tecnologie commerciali più utilizzate sono il sequenziamento SMRT (Single Molecule Real-Time) di Pacific Biosciences (lunghezza di lettura media ~ 20 kb con un'accuratezza >99,9% per letture HiFi) e la Tecnologia Oxford Nanopore (con un'accuratezza di circa 99%) (https://doi.org/10.1038/s41592-022-01759-x).
PacBio, con i suoi strumenti di terza generazione, Sequel II/ IIe e il REVIO, sta rendendo sempre più affrontabile il sequenziamento long-reads, consentendo il sequenziamento completo del genoma umano in meno di un giorno ed un abbattimento dei costi superiore al 50%. (https://www.pacb.com/revio/).
Sebbene la tecnologia di Terza generazione, Hi-Fi, rappresenti un’avanguardia e permetterà maggiori scoperte nell’ambito della comprensione di sequenze complete, l’NGS rimane, al momento, la tecnologia di elezione nel sequenziamento associato alla diagnostica oncologica, lo screening prenatale e la selezione terapeutica.
Dall'avvento del sequenziamento di nuova generazione, quasi due decenni fa, il ritmo dell'innovazione tecnologica non ha mai rallentato. Il sequenziamento di II generazione, grazie anche al progresso incessante, continua a vivere un interminabile momento di notorietà.
PacBio sta infatti per introdurre nel mercato NGS una nuova soluzione, che appare oggi tra le più promettenti nell’ambito della seconda generazione, il sequenziatore ONSO, che grazie all’approccio Sequencing by binding (SBB) permette di ottenere dati di lettura con un’accuratezza compresa tra Q40 e Q50 (https://www.pacb.com/onso/).
Questo, associato anche allo sviluppo continuo di potenti algoritmi per l’allineamento e l’analisi, sta permettendo di superare i classici ostacoli alla decodifica di sequenze complete, che spesso si traducevano in molte parti mancanti ed errori.
Riferimenti:
https://www.nature.com/articles/s41592-022-01759-x
https://www.science.org/doi/10.1126/science.abj6987
